Kamis, 21 Juli 2011

Tanya Jawab Seputar Analisa DNA Sequencing


Sequencing Diagram1. Apakah Sanger Dideoksi Sequencing itu dan apa bedanya dengan Fluorescent Sequencing Applied Biosystems?
Dengan Sanger Sequencing, DNA polymerase menyalin utas tunggal cetakan (template) DNA, dengan penambahan nukleotida kepada rantai yang terbentuk (produk ekstensi). Permanjangan rantai terjadi pada ujung 3′ dari primer, oligonukleotida yang menempel (anneal) pada template. Deoksinukleotida yang ditambahkan pada produk ekstensi dipilih berdasarkan pasaan basa yang cocok dengan template. Produk ekstensi tumbuh dengan pembentukan jembatan fosfodiester antara gugus 3′-hydroksil pada ujung primer yang memanjang dan gugus 5′-fosfat dari deoksinukleotida yang masuk (Watson et al, 1987). Pemanjangan terjadi pada arah 5′ -> 3′ (lihat gambar 7).
Gambar 7: Sintesis Utas DNA melalui pembentukan ikatan fosfodiester
DNA polymerase dapat berinkorporasi juga dengan basa nukleotida analognya. Metode dideoksi pada DNA sequencing yanG dikembangkan oleh Sanger et al. (1977) memanfaatkan keuntungan kemampuan ini dengan menggunakan 2′-3′-dideoksi sebagai substrat. Ketika sebuah dideoksinukleotida berinkorporasi pada ujung 3′ rantai yang sedang memanjang, pemanjangan rantai dihentikan secara selektif pada A, C, G atau T, karena rantai kekurangan gugus 3′-hidroksil (lihat gambar 8).
Gambar 8: Empat warna/sequencing fluorescent satu lajur vs Satu warna/Sequencing Empat Lajur
2. Apakah Cycle Sequencing itu?
Cycle Sequencing adalah sebuah metode sederhana dimana pengulangan denaturasi, annealing dan ekstensi secara berturut-turut dalam thermal cycler menghasilkan amplifikasi linear produk-produk ekstensi (lihat gambar 9). Produk ini kemudian di-load kedalam del atau diinjeksikan ke dalam kapiler. Applied Biosystems menggunakan protokol cycle sequencing ini dalam kit DNA sequencingnya.
Gambar 9: Amplifikasi Linear Produk Ekstensi
3. Apakah keuntungan dari cycle sequencing?
Keuntungannya adalah sebagai berikut:
  • Protokolnya sangat baik dan mudah untuk dilakukan
  • Cycle sequencing membutuhkan DNA template yang jauh lebih sedikit dibandingkan metode ekstensi temperatur tunggal.
  • Cycle sequencing lebih sesuai dibandingkan metode pelabelan temperatur tunggal tradisional yang membutuhkan langkah denaturasi kimiawi untuk template utas ganda.
  • Temperatur yang tinggi mengurangi struktur sekunder sehingga ekstensi berjalan lebih sempurna
  • Temperatur tinggi mengurangi annealing sekunder primer ke template
  • Protokol yang sama digunakan untuk DNA utas ganda maupun utas tunggal
  • Protokol ini bekerja dengan baik untuk sequencing langsung PCR produk
  • Template-template yang sulit, seperti bacterial artificial chromosomes (BACs), dapat disekuen
4. Apakah Dye Terminator Cycle Sequencing itu?
Dengan pelabelan dye terminator, masing-masing keempat dideoxy terminators (ddNTPs) ditandai dengan suatu fluorescent dye yang berbeda-beda. Rantai yang tumbuh diterminasi dan dilabel secara simultan dengan dye yang berkorespondensi dengan basa tersebut (lihat gambar 10). Suatu primer yang tidak dilabel dapat digunakan. Reaksi dye terminator dapat dilakukan dalam sebuah tabung. Protokol ini membutuhkan langkah pemipetan yang lebih sedikit dibanding reaksi dye primer. Reaksi yang dilabel dengan empat warna dye di-load dalam sebuah lajur gel tunggal atau satu injeksi kapiler. Jika terjadi kesalahan terminasi, yaitu fragmen yang tidak diterminasi oleh dideoksinukleotida, maka tidak akan terdeteksi karena tidak ada dye yang menempel.
Gambar 10: Fitur-fitur reaksi Dye-Labeled Terminator
5. Apakah Dye Primer Cycle Sequencing itu?
Dengan pelabelan dye primer, primer ditandai dengan empat pewarna fluorescent yang berbeda. Produk terlabel terbentuk dalam empat reaksi spesifik basa yang berbeda. Produk dari keempat reaksi ini lalu dicampur dan di-load kedalam satu lajur gel atau satu injeksi kapiler (lihat gambar 11). Dye primer chemistries umumnya menghasilkan intensitas sinyal yang lebih baik dibanding dye terminator chemistries. Primer yang terlabel tersedia secara komersial untuk situs-situs primer yang umum. Kita dapat juga melabel custom primer. Reaksi yang dilabel dengan empat warna dye di-load ke dalam lajur tunggal atau satu injeksi kapiler.
Gambar 11: Fitur-fitur of Dye-Labeled Primer Reactions
6. Apakah Matrix Standard itu?
Overlap spektral yang presisi antara keempat dye diukur dengan menjalankan (running) fragmen DNA yang dilabel menggunakan masing-masing dye dalam kalibrasi spektral pada mesin ABI PRISM® Genetic Analyzer. Fragmen DNA yang dilabel dye ini dinamakan matrix standards. Software Data Utility kemudian menganalisa data dari sample matrix standard dan membuat file matrix. Nomor-nomor ini adalah internetan fluorescent yang dinormalisasi dan merepresentasikan suatu deskripsi matematis overlap spektral yang teramati diantara dye-dye. File-file matrix dalam file instrumen digunakan untuk jenis chemistry yang spesifik, dan menyediakan informasi bagi software Sequence Analysis sehingga memungkinkannya untuk mengkoreksi overlap spektral.
7. Apakah BAC End-Sequencing itu?
Bacterial artificial clones alias BAC adalah segmen besar DNA (100kb-200kb) yang diklonkan ke dalam bakteri dari spesies lain. Beberapa salinan dapat dibuat setelah kloning. Sekuen dari ujung BAC menyediakan penanda yang sangat spesifik. Sekuen ini kemudian dapat dibandingkan dengan pustaka BAC untuk konformasi.
8. Apakah yang dimaks dengan “Checking Clone Constructs”?
Ini merupakan cara untuk memverifikasi bahwa DNA yang kita inginkan sudah diklon dengan baik kedalam vektor menggunakan DNA sequencing.
9. Apakah Multicomponent Analysis itu?
Multicomponent analysis merupakan proses yang memisahkan keempat warna dye fluorescent menjadi komponen-komponen spektral tersendiri. Meskipun setiap dye mengemisikan fluoresensi maksimumnya pada panjang gelombang yang berbeda, terdapat beberapa overlap pada spektrum emisi antara keempat dye (lihat gambar 12). Tujuan multicomponent analysis adalah mengisolasi signal dari setiap dye sehingga noise pada data menjadi sesedikit mungkin.
Gambar 12: Multicomponent Analysis
10. Apakah De Novo Sequencing itu?
Proses eksperimental penentuan urutan basa nukleotida suatu daerah (region) DNA dengan melabel setiap nukleotida dengan penanda fluorescent untuk mengidentifikasinya.
11. Apakah yang dimaksud dengan Multi-Locus Sequence Typing (MLST)?
MLST adalah suatu prosedur yang tidak ambigu untuk mengkarakterisasi isolat bakteri menggunakan sekuen fragmen internal dari 7 gen housekeeping. Prosedur ini menggunakan fragmen internal (~450-500 bp) dari setiap gen, sehingga mereka dapat disekuen pada kedua utasnya secara akurat dengan mesin DNA sequencer terotomatisasi. Untuk setiap gen housekeeping, sekuen-sekuen yang terdapat dalam suatu spesies bakteri dinyatakan sebagai alel yang jelas, dan untuk setiap isolat, alel pada masing-masing ketujuh loci mendefinisikan profice allelic atau jenis sekuen (IST)
12. Apakah yang dimaksud dengan Deteksi berbasis SNP atau Resequencing?
Sebuah heterozygote mengandung alel-alel yang berbeda pada suatu locus (posisi) pada kromosom homolog. Deteksi heterozygote dilakukan dengan primer spesifik.
13. Apakah HLA Typing itu?
Pengujian human leukocyte antigen (HLA) mendeteksi antigen-antigen (penanda genetik) pada sel darah putih. Terdapat 4 jenis human leukocyte antigens yaitu: HLAA, HLAB, HLAC, dan HLAD. Tes HLA menguji kompatibilitas jaringan dan penentuan jenis jaringan reseptor/donor. Tes ini juga digunakan pada konseling genetik dan pengujian paternitas. (hanya untuk riset.)
14.apakah Deteksi Metilasi itu?
Metilasi DNA terjadi pada situs CpG, yang mana sekuen DNA dengan sitosin berada dekat dengan guanin. Metilasi dimediasi oleh suatu enzim (DNA methyltransferase). Situs CpG jarang terdapat pada genom eukariot, kecuali pada wilayah yang dekat dengan promoter suatu gen eukariotik. Wilayah ini dikenal sebagai CpG islands, dan keadaan metilasi pada situs-situs CpG penting bagi aktifitas/ekspresi gen.
15. Apakah mtDNA sequencing itu?
mtDNA adalah kependekan dari mitokondria. Molekul mitokondrial terdapat dalam jumlah 100-1000 salinan per sel, lain dengan DNA inti yang terdapat hanya dua salinan per sel. Banyaknya mtDNA memungkinkan diskriminasi antara individu-individu atau sampel-sampel biologis, khususnya jika DNA inti rusak atau tidak tersedia.
16. Apakah yang dimaksud dengan Comparative Genomic Resequencing?
Comparative Genomic Resequencing adalah perbandingan genom-genom dan individu-individu dalam suatu genom. Comparative genomics memungkinkan aplikasi informasi yang diperoleh dari suatu genom sampel menjadi suatu genom yang lebih kompleks. Ini merupakan dasar untuk memahami variasi genetik dalam suatu populasi.
17. Apakah Deteksi Mutasi Non-SNP itu?
Mutasi deteksi Non-SNP adalah suatu Resequencing dimana perbandingan suatu sekuen dengan suatu sekuen referensi dilakukan menggunakan mutasi-mutasi Non-SNP, seperti insersi dan delesi.
18. Apakah Metode SAGE™ itu?
SAGE™ adalah sebuah motede untuk analisa kuantitatif, pola ekspresi gen pada genome. Suatu tag sekuen pendek (10 – 25 bp) mengandung informasi yang cukup untuk mengidentifikasi suatu transkrip.
19. Apakah yang dimaksud dengan profiling mutasi menggunakan analisa, deteksi atau validasi SNP itu?
Sebuah single nucleotide polymorphism (SNP) adalah substitusi satu basa atas yang lainnya. Beberapa metode berbasis sequencing tersedia untuk pencarian dan analisa SNP.
Diterjemahkan dengan modifikasi dari situs www.appliedbiosystems.com
Jika menurut sobat artikel ini bermanfaat, silahkan vote ke Lintas Berita agar artikel ini bisa di baca oleh orang lain.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar